Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

ПЦР-диагностика: принцип работы и возможности

Существующий чуть более 30 лет, метод диагностики инфекций с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) эволюционировал значительно и стал одним из наиболее точных и широко используемых способов выявления патогенных микроорганизмов.

Основой ПЦР является многократное увеличение концентрации фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. Этот процесс делает возможным копирование участка ДНК, который существует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

За несколько минут и несколько десятков циклов амплификации можно получить количество молекул, достаточное для дальнейшего анализа. Кроме того, с помощью ПЦР можно проводить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это делает ПЦР полезным не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Проведение ПЦР-диагностики требует специального оборудования и производится в специальных лабораториях. На сегодняшний день существует множество различных модификаций метода, включая технологии с использованием кислоты РНК. В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре и для их проведения не требуется специальное оборудование.

Популярным среди различных модификаций является "горячий старт ПЦР", который предварительно прогревает пробирки с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут для предотвращения клонирования неспецифических фрагментов ДНК.

Еще одной популярной модификацией является мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование нескольких фрагментов в одной пробирке. Это позволяет сократить время и затраты на проведение анализа и повысить точность исследования методом ПЦР.

Метод ПЦР-диагностики в клинической медицине широко используется во многих областях, включая урогинекологию, неонатологию, службу крови, клинику инфекционных заболеваний, фтизиатрию и пульмонологию.

В урогинекологии, где инфекционные заболевания могут вызвать бесплодие и невынашивание беременности у женщин, метод ПЦР позволяет выявить целый "букет" половых инфекций, включая хламидиоз, микоплазму, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Выявление этих инфекций своевременно помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин. Также метод ПЦР используется для выявления вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, в особенности вирус Герпеса и вирус папилломы человека.

В неонатологии метод ПЦР-диагностики позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.

В службе крови метод ПЦР-диагностики применяется для избежания риска переливания пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты. Этот метод превосходит по точности серологические методы, так как он способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

Клиника инфекционных заболеваний также использует метод ПЦР-диагностики. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия и токсоплазмоз.

В фтизиатрии и пульмонологии метод ПЦР-диагностики позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Кроме того, с помощью этого метода можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР также используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Заметим, что метод ПЦР-диагностики широко используется не только в клинической медицине, но и в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Диагностика методом ПЦР: какие цены на проверку инфекций?

Стоимость диагностики методом ПЦР напрямую зависит от вида изучаемой инфекции, количества анализов, а также от качества и способа тестирования. Врачебные клиники устанавливают свои цены, что может привести к различиям в стоимости одного и того же анализа в разных клиниках.

За проведение диагностики одной инфекции обычно просят от 200 до 800 рублей, но стоимость может меняться в зависимости от медицинского учреждения. Кроме того, следует учитывать, что к оплате за диагностику нередко добавляется плата за взятие биоматериала, чья стоимость составляет около 400 рублей. В следующей таблице представлены приблизительные цены на некоторые виды ПЦР-анализов в Москве:

Помимо этого, многие клиники проводят комплексную диагностику, включающую сразу несколько анализов. Так, например, клиника может предложить комплексный анализ "ПЦР-8" на 8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций за 1400 рублей или "ПЦР-12" на 12 половых инфекций за 3500 рублей. Такой подход к диагностике может существенно снизить затраты на проверку на инфекции, так как при прохождении анализов по отдельности цены могут быть гораздо выше.

Фото: freepik.com